CYTOMÉTRIE EN FLUX

Le principe de la cytométrie en flux repose sur le guidage de cellules en suspension dans un flux laminaire liquide assurant leur passage « en file indienne » devant le système d'illumination, pour permettre leur analyse dans un temps très court, de l'ordre de quelques microsecondes

La cytométrie en flux a largement contribué à l'exploration de la cellule, en combinant l'aspect analytique et préparatif. En association avec l'utilisation de sondes (fluorochromes, substrats fluorogènes, anticorps monoclonaux), elle permet de multiples investigations concernant notamment la caractérisation de populations cellulaires, l'exploration du fonctionnement cellulaire, l'analyse de constituants cellulaires (acides nucléiques, protéines, antigènes de surface ou intracellulaires, activités enzymatiques, potentiel membranaire, activité mitochondriale, pH intracellulaire, flux ioniques, fluidité membranaire...).

Largement reconnue, la cytométrie en flux a détrôné la microscopie conventionnelle pour des applications particulières en immunologie, hématologie et cancérologie, notamment par le typage lymphocytaire et la mesure du contenu en ADN. La plupart des applications ont concerné la détection des antigènes membranaires et l'étude du cycle cellulaire.

Applications

L'analyse du contenu en ADN demeure l'une des principales applications de la cytométrie en flux. La mesure monoparamétrique est couramment employée pour déterminer la répartition des cellules dans les phases du cycle cellulaire : les principales limites concernent la distinction – sur la base du contenu en ADN – des cellules en phase G2, en mitose, et des cellules binucléées, d'une part, ainsi que la distinction entre les cellules en G1, les cellules quiescentes ou différenciées, d'autre part. Plusieurs fluorochromes sont capables de révéler l'ADN, parmi lesquels : les intercalants (iodure de propidium, bromure d'éthidium), les dérivés du benzimidazole (Hoechst 33258 et 33342) et des antibiotiques fluorescents (mithramycine).

Les résultats de l'analyse de l'ADN par cytométrie en flux doivent être clairement différenciés de ceux qui sont obtenus par les techniques de cytogénétique, dont l'objectif est d'identifier les chromosomes en vue d'établir le caryotype d'un sujet. La cytométrie permet, au contraire, de mesurer le contenu cellulaire en ADN (au sens pondéral) à partir de la relation linéaire entre la quantité de fluorescence émise par le fluorochrome fixé par le noyau cellulaire et la quantité d'ADN présent.

Pour déterminer l'indice d'ADN, on compare le contenu en ADN de la population cellulaire étudiée avec celui d'une référence disponible et stable, c'est−à−dire une suspension de cellules nucléées dont le contenu en ADN est connu et proche de celui de l'échantillon testé, sans lui être identique. Préparée de manière identique à l'échantillon afin que les mesures soient comparables et reproductibles, la référence doit être mélangée à l'échantillon avant tout traitement. On utilisera par exemple, comme référence, des érythrocytes de truite (variété arc−en−ciel) qui renferment 4,9 picogrammes d'ADN par noyau cellulaire.

L'expression de l'indice d'ADN doit toujours faire référence au mode de préparation des cellules, à la nature de la référence et à la nature du colorant.

Caryotype en flux. La mise en suspension des chromosomes (après blocage des cellules en métaphase de la mitose) permet d'obtenir une suspension de chromosomes analysables, après coloration spécifique. Le caryotype en flux a deux finalités : la mise en évidence du polymorphisme de certains chromosomes (1, 9, 16 ou Y chez l'homme) et la constitution de banques génomiques par tri physique.

Le typage lymphocytaire, couramment réalisé[...]