ÉDITION DES GÉNOMES

La révolution des outils d’édition des génomes

Cette démarche de construction de sites de reconnaissance programmés selon les besoins d’une expérience n’est pas à la portée de tous les laboratoires. Plusieurs autres systèmes d’édition des génomes ont donc été mis au point à partir de l'an 2000 mais l’usage pratique de ces systèmes n’explose véritablement qu’à partir de 2012 : on passe alors d’une moyenne de 100 publications annuelles jusqu’à cette date, à 2 400 pour la seule année 2017. Ce développement brutal coïncide avec l’introduction en 2012 du système  CRISPR-Cas9, d’emploi beaucoup plus facile que les autres.

Le principe d’action de ces outils moléculaires nouveaux est le même que pour les méganucléases. Il repose sur la reconnaissance par la protéine d’une longue séquence d’ADN, suivie par la coupure de l’ADN en un endroit précis déterminé par la séquence ou situé immédiatement à côté d’elle. Ces deux activités – reconnaissance et coupure – peuvent être portées par la même molécule. C’est le cas des méganucléases naturelles. Il n’en est pas de même pour les trois autres principaux systèmes d’édition : les nucléases « à doigts de zinc », les TALEN (transcription activator-like effectornucleases) et le système CRISPR-Cas9 (clusteredregularlyinterspaced short palindromicrepeatCRISPR-associatedprotein type 9). Ces trois derniers outils sont des protéines mono- ou polymériques, et le site de reconnaissance et le site de coupure sont portés par des protéines d’origine différente, raboutées par une construction moléculaire. Les outils d’édition « à doigts de zinc » sont des dimères dont les deux sous-unités sont constituées chacune par trois (ou davantage) fragments de protéines (domaines) issus de protéines dites « à doigts de zinc », protéines qui contrôlent normalement l’activité de certains gènes, ont de l’affinité pour des séquences précises de l’ADN et sont ainsi nommées parce que des atomes de zinc stabilisent leur structure. L’une des deux sous-unités reconnaît une séquence de 9 à 12 nucléotides, sur un brin de l’ADN, tandis que la seconde en reconnaît une autre également longue de 9 à 12 nucléotides sur l’autre brin. Ces deux séquences encadrent le site de coupure reconnu par le domaine de clivage de l’enzyme de restriction Fok1 associé à cette construction. Les TALEN sont également dérivées de protéines régulatrices de l’expression des gènes, trouvées dans la bactérie Xanthomonas. Ces protéines reconnaissent des séquences de 14 à 16 nucléotides disposés de manière symétrique par rapport au site de coupure de l’enzyme de restriction Fok1. Ces deux outils d’édition que sont les nucléases « à doigts de zinc » et les TALEN demandent à être adaptés à chaque travail particulier, exigeant de ce fait des modifications délicates de la séquence en acides aminés des protéines de reconnaissance, de façon à les faire interagir avec la séquence d’ADN sur laquelle on souhaite intervenir.

En revanche, l’outil CRISPR-Cas9 est infiniment plus simple à programmer car la reconnaissance de la séquence unique d’ADN est assurée par un ARN guide de séquence complémentaire à la séquence d’ADN à modifier, facile à synthétiser. Dans la construction du complexe CRISPR-Cas9, on a tiré parti des propriétés d’un système de protection répandu dans le monde des archées et des bactéries, ici le système CRISPR de la bactérie lactique Streptococcus thermophilus. Découvert en 2008, un ARN guide de cette dernière bactérie associe la reconnaissance par l’ARN guide d’une séquence particulière de l’ADN qui lui est complémentaire et la coupure par une endonucléase au voisinage de la séquence reconnue. L’outil moléculaire d’édition associant donc le système CRISPR du streptocoque pour la reconnaissance à l’enzyme[...]