ÉLECTROPHORÈSE

Mesures sous microscope

Ces mesures, effectuées dans des canaux très fins, se compliquent du fait de la superposition de deux phénomènes : l'électrophorèse (déplacement des particules par rapport au liquide) et l'électro-osmose (déplacement du liquide le long des parois du canal).

On opère souvent selon la méthode d' Ellis : deux petits récipients communiquent par un « canal capillaire » long de quelques centimètres, généralement de section rectangulaire et de très faible épaisseur. La cellule est complètement remplie de la suspension à étudier ; on introduit dans les petits récipients des électrodes montées sur des bouchons qui assurent la fermeture étanche de la cellule.

Une différence de potentiel électrique connue est établie entre les électrodes : la valeur du champ électrique qui règne dans le canal peut être déduite de cette différence de potentiel ou, parfois, contrôlée grâce à une paire d'électrodes-sondes placées aux extrémités du canal. Dans ce champ électrique, le liquide de suspension est entraîné par électro-osmose le long des parois, mais, comme la cellule est close, ce liquide reflue en sens inverse dans la portion axiale du canal. Dans le cas d'un canal de section rectangulaire et de très faible épaisseur, les lois de l'hydrodynamique montrent que les vitesses du liquide par rapport aux grandes parois sont représentées, en fonction de la distance à l'une de ces parois, par un arc de parabole et qu'il existe deux plans parallèles aux grandes parois (plans stationnaires) au niveau desquels le liquide reste immobile ; les distances de ces plans à l'une des grandes parois du canal sont approximativement égales à 21 p. 100 et à 79 p. 100 de l'épaisseur du canal. Si l'on met un microscope exactement au point sur l'un des deux plans stationnaires, la vitesse directement mesurée sur les particules visibles avec netteté est leur vitesse d'électrophorèse.

La mobilité électrophorétique s'obtient en divisant la vitesse d'électrophorèse par la valeur du champ électrique dans le canal.

Mesures de la mobilité de macromolécules en solution

On utilise fréquemment un appareil de type Tiselius, où l'épaisseur des canaux des cellules est de l'ordre de plusieurs millimètres.

La cellule, soigneusement thermostatée, constitue, en position de mesure, un tube en U dans lequel sont superposés la solution macromoléculaire à étudier et son solvant (par exemple une solution de protéine dans un tampon et le tampon pur) ; la solution de plus forte densité (en général la solution macromoléculaire) doit être placée au-dessous de la solution de plus faible densité. À leur partie supérieure, les deux branches du tube en U communiquent avec des récipients contenant les électrodes. Dans une portion verticale de chacune des branches du tube en U, on crée, immédiatement avant de faire passer le courant électrique, une frontière aussi nette que possible entre la solution et son solvant. Il existe plusieurs techniques pour créer ces frontières précises. Dans l'appareil de Tiselius, le tube en U est sectionné en cinq tronçons, dont deux tronçons verticaux solidaires l'un de l'autre, formant un bloc qui peut glisser comme un tiroir aux joints parfaitement étanches entre la portion inférieure du tube en U et le bloc constitué par les deux portions supérieures ; la portion inférieure, indépendamment, peut aussi glisser le long de la base du « tiroir » médian. Grâce à un jeu convenable des parties mobiles, on emplit d'abord la portion inférieure du tube de solution, puis l'un des tronçons médians de tampon pur et l'autre de solution, enfin les branches supérieures de tampon pur ; on pousse alors les tiroirs de façon à reconstituer le tube en U ; puis, en déplaçant le liquide dans le tube, on amène les deux frontières à un niveau où leur examen optique est possible, c'est-à-dire dans les tronçons médians. S'il n'existe en solution qu'une seule espèce macromoléculaire, ou si les mobilités de toutes les espèces présentes sont de même signe dans les conditions de l'expérience, un champ électrique donné déplacera l'une des frontières vers le haut (branche ascendante), l'autre vers le bas (branche descendante) ; en même temps, les frontières perdent de leur netteté initiale en raison de la diffusion. Dans d'autres types d'appareils, on crée la frontière par aspiration latérale.

Le déplacement de la frontière peut s'observer directement si la macromolécule est colorée (hémoglobine par exemple) mais, dans le cas général, on utilise divers procédés optiques (interférométrie, dispositif de Philpot-Svensson) reposant sur la variation d'indice de réfraction de la solution macromoléculaire avec sa concentration, qui permettent de suivre le déplacement du plan où le gradient est maximal ; ces procédés sont analogues à ceux que l'on emploie pour suivre un déplacement de frontière provoqué par ultracentrifugation.

Si la solution contient plusieurs types de macromolécules, de mobilités différentes, la frontière initiale se résout en général en plusieurs frontières qui se déplacent avec des vitesses différentes.

Remarquons que l'électro-osmose le long des parois de la cellule ne déforme pratiquement pas l'horizontalité des zones frontières dans les canaux verticaux et de large section des appareils de ce type, à condition toutefois qu'il y ait entre la solution et son solvant une différence de densité suffisante pour que les effets hydrostatiques rétablissent à chaque instant cette horizontalité.

La figure représente un diagramme d'électrophorèse obtenu à l'aide du dispositif Philpot-Svensson, relatif au sérum sanguin humain.