ÉLECTROPHORÈSE

Électrophorèse sur papier et sur acétate de cellulose

On dépose quelques microlitres de la solution à étudier (mélanges d'enzymes, de protéines sériques ou d'autres substances chargées) sous forme d'une ligne mince sur le support imbibé de tampon. On le soumet ensuite à une électrophorèse ; l'intensité du courant est voisine de 2 mA par centimètre de largeur du support.

Au bout de quelques heures, la feuille est séchée. Les différentes fractions sont révélées par des colorants spécifiques, qui permettent de caractériser, par exemple, les protéines, les glycoprotéines, les lipoprotéines. Quant aux enzymes, on peut les révéler en utilisant leur activité spécifique sur des substrats convenablement choisis.

Le pouvoir de résolution de cette technique n'est pas supérieur à celui de l'électrophorèse en veine liquide. Par exemple, à partir du sérum, on obtient six fractions : albumine , α₁, α₂, β₁, β₂ et γ-globulines.

L'interaction entre le support et les protéines n'est pas totalement négligeable, c'est là un inconvénient. Si elle est faible avec l'acétate de cellulose, elle est plus marquée avec le papier filtre. C'est pourquoi, dans les conditions normales, on ne peut déceler, avec ce support, dans le cas d'un sérum, les préalbumines, qui devraient migrer plus vite que l'albumine, mais qui sont freinées par leur adsorption par le papier. On y parvient cependant, par exemple, en augmentant la quantité de protéines déposée.

Électrophorèse en gel d'agar (gélose)

Le support est constitué à l'aide d'une solution de gélose (agar-agar) à 1 p. 100 dans le tampon choisi. On la coule à chaud sur une lame de verre où elle se solidifie par refroidissement. Le pouvoir de résolution est identique à celui du papier. Mais le gel d'agarose purifiée présente l'avantage de ne pas produire d'interaction avec les protéines.

Pour augmenter le nombre de fractions protéiques séparées par l'électrophorèse, on a proposé d'autres supports qui se comportent comme des tamis moléculaires. Il s'agit de gels poreux qui, par un phénomène de friction, retardent d'autant plus la migration des protéines que les dimensions de leurs molécules sont plus grandes. Ainsi le groupe des α₂-globulines peut être résolu en une dizaine de constituants. On signalera les deux principaux procédés dans les paragraphes ci-dessous.

Électrophorèse en gel d'amidon

Elle a été proposée par Smithies en 1955. Elle utilise un amidon partiellement hydrolysé avec lequel on fait un gel contenant de 13 à 15 g d'amidon pour 100 ml de tampon. Le mélange, fluide à l'ébullition, est coulé dans un bac où il se prend en gel par refroidissement. On insère les protéines à séparer dans une fente pratiquée dans le gel. Après électrophorèse, on coupe le gel dans son épaisseur et on révèle les protéines par un des colorants habituels.

Avec un sérum humain, on peut obtenir près d'une vingtaine de bandes. L'opération complète demande au minimum quinze heures.

Électrophorèse en gel d'acrylamide

Elle a été décrite par S. Raymond et Weintraub en 1959, par B. J. Davis et L. Ornstein la même année. C'est une méthode très fine de séparation par simple électrophorèse sur support.

Une solution d'acrylamide, coulée dans de petits tubes verticaux, forme un gel par polymérisation. Les pores ont un diamètre de 5 nm environ. Les protéines à séparer sont déposées à une extrémité du gel dans lequel elles se déplacent sous l'action du champ électrique.

Après coloration, les protéines sont visibles sous forme de disques parallèles, superposés, d'où le nom de Disc-electrophoresis utilisé par les Anglo-Saxons.

Cette technique est rapide, précise, reproductible, sensible. Un sérum humain est résolu en au moins une vingtaine de fractions.

Le polyacrylamide ne donne aucune réaction avec les colorants, ni les protéines, ni les polysaccharides, ni les lipides. Le gel est transparent. Il permet une évaluation densitométrique plus aisée que celle obtenue lorsqu'on utilise le papier comme support.

Électrophorèses préparatives sur support

On a décrit plusieurs procédés qui permettent de séparer des groupes de protéines (albumine, α₁, α₂, β₁, β₂, γ-globulines) en vue de préparer ces fractions à partir, par exemple, d'un sérum. À cet effet, on utilise des portoirs de grandes dimensions dans lesquels on met une pâte d'amidon, ou de tout autre support neutre comme le Pévikon (chlorure de polyvinyle), ou même des gels (gélose, amidon, etc.). L'opération terminée, on découpe le support en tranches d'où l'on élue les protéines. Cette technique est évidemment utilisable pour préparer toute substance isolée par l'électrophorèse sur ce genre de support.

Électrophorèse à haute tension

L'emploi de tensions élevées – de l'ordre de 3 000 à 5 000 volts – permet de séparer, par électrophorèse à une ou deux dimensions perpendiculaires, des substances telles que peptides et acides aminés. On utilise une feuille de papier de 30 × 40 cm, placée entre deux plaques isolantes, refroidies à + 2 ⁰C pour éviter que la feuille ne se dessèche et, finalement, ne se consume. L'appareillage nécessaire est assez onéreux. Un dispositif plus simple consiste à immerger la feuille à électrophorèse dans de l'éther de pétrole, lui-même refroidi par un serpentin.

La haute tension permet de séparer en une heure un mélange de substances comme les peptides obtenus par hydrolyse enzymatique d'une protéine. La « carte » obtenue par deux électrophorèses perpendiculaires avec deux tampons différents (ou une chromatographie dans une direction suivie d'une électrophorèse dans l'autre) constitue un diagramme caractéristique comme l'est une empreinte digitale, d'où le terme finger-print donné par les Anglo-Saxons à cette technique.