ENZYMES Site actif

Structure et évolution des sites actifs

Le site actif apparaît alors sous la forme d'une petite cavité de la protéine enzyme. Cette cavité est définie par des replis de la chaîne polypeptidique de l'enzyme qui rapprochent des acides aminés souvent éloignés le long de la séquence d’acides aminés. Ce repli présente sur la face interne de la cavité (souvent à dominante hydrophobe) des radicaux latéraux d'acides aminés (OH, NH ou NH₂, protons échangeables) dans une disposition caractéristique. Les atomes ou radicaux du substrat interagissent avec les atomes et radicaux du site actif par le biais de liaisons faibles en énergie, liaisons hydrogène, de Van der Waals, interactions électrostatiques, interactions hydrophobes, etc., dont l'ensemble va définir une constante d'association. Le plus souvent, un groupement réactif de l'enzyme, ou bien exogène, est orienté vers le point précis du substrat où va être opérée la modification chimique catalysée. C'est à travers cette interaction complexe entre radicaux réactifs du site actif de l'enzyme et positionnement dans l'espace de la liaison à modifier du substrat qu'est stabilisé le complexe ES, que l'état de transition devient manifeste, que l'énergie d'activation est suffisamment abaissée pour que la réaction ait lieu et qu'enfin le produit (P), le substrat modifié et l'enzyme inchangée soient libérés.

L'identification des acides aminés impliqués dans la fixation du substrat et dans la réaction est réalisée par leur modification sélective (par des réactifs des radicaux –SH, 0H, –NH2, etc.) et, surtout, par mutagenèse dirigée du gène de l'enzyme de façon à remplacer l'acide aminé supposé actif par un résidu neutre comme l'alanine, qui ne modifie pas le repliement de la molécule et n'intervient dans aucun mécanisme réactionnel. La mutagenèse dirigée est également utilisée pour modifier les propriétés de l'enzyme, voire sa spécificité vis-à-vis des substrats. On notera qu'aucune méthode de détermination de la structure du site actif n'est entièrement valide à elle seule : même la diffraction des rayons X donne une image statique au sein d'un cristal qui privilégie un état particulier, sans doute le plus stable, du complexe ES. Cette approche doit donc être complétée par d'autres techniques, dont le rayonnement monochrome d’un synchrotron à rayons X, qui permet même de suivre la réaction directement.

La comparaison des structures de différents sites actifs montre que, pour une famille de substrats et pour un type de réaction donnés, les mêmes éléments structuraux sont utilisés. Ils sont dus à de courtes séquences d’acides aminésconservées. C'est ainsi que la structure du site actif des ses dites à sérine – parce que la sérine fait partie du site actif – est toujours la même. Tous les sites des enzymes qui catalysent l'échange de phosphate des nucléosides monophosphates sont caractérisés par un feuillet bêta central flanqué de deux hélices alpha latérales et une boucle entre le premier segment b et la première hélice, boucle dite P, caractéristique de l'interaction avec le phosphate et invariablement déterminée par la séquence Gly-XXXX-Gly-Lys. Le reste de la molécule peut être parfaitement divergent selon les enzymes, leur spécificité vis-à-vis du substrat et leur origine. Une observation de ce type a été réalisée aussi sur des familles de déshydrogénases. Cette récurrence de motifs structuraux fonctionnels insérés dans des séquences d’acides aminés différentes peut être due soit à leur conservation au cours de l’évolution, soit à une convergence fonctionnelle. En tout état de cause, cette constance n’est pas différente de la récurrence de motifs structuraux dans les protéines, comme le domaine immunoglobuline, les domaines [...]