ENZYMES Site actif

L'équation de Michaelis-Menten

L'ensemble du processus de catalyse enzymatique qui survient dans le site actif est donc, schématiquement, déterminé par la concentration en sites enzymatiques occupés par le substrat. On peut ainsi écrire la réaction enzymatique sous la forme simple : enzyme + substrat → complexe enzyme-substrat → enzyme + produit (E + S → ES → E + P).

Dans ces conditions et sous réserve que la réaction étudiée soit à un seul substrat (ou, s'il en existe plusieurs, que la concentration de ces derniers soit maintenue constante et optimale), que l'on mesure les vitesses initiales d'apparition du produit P, que la concentration en enzyme soit constante et qu'enfin l'environnement physico-chimique (solvant, tampon, ions cofacteurs, température, pH) soit constant, alors la vitesse v de production de P observée pour une concentration constante de S s'écrit comme v = V_ps/(K_M + s) où V_p est la vitesse maximale de production de P (on l'écrit en général V_max), K_M la constante dite de Michaelis, et s la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction est égale à la moitié de la vitesse maximale. Cette équation, établie en1911, est appelée équation de Michaelis-Menten et garde toute sa validité.

Pour déterminer ces valeurs, on réalise en général d'abord une mesure de la vitesse initiale de production de P en présence d'une concentration croissante de substrat. La courbe est hyperbolique et on ne peut extrapoler directement ni V_max ni K_M. On utilise donc de préférence la représentation de Lineweaver et Burk (1932) dans laquelle 1/v = (K_M/V_max s) + (1/V_max). Cette représentation est commode puisque lorsque l'on représente 1/v en fonction de 1/s, la droite obtenue coupant l'axe des ordonnées en 1/V_max et celle des abscisses en –1/K_M, extrapolation graphique qui donne immédiatement les valeurs caractéristiques de l'enzyme. On notera que K_M n'a de réalité physique qu'apparente car il dépend des valeurs prises par les autres constantes de la réaction,dont on ignore en général les contributions respectives. On admet, et l'approximation est en général bonne, que K_M indique un ordre de grandeur de l'affinité de l'enzyme pour son substrat tandis que la constante cinétique V_maxdonne accès au nombre de molécules de substrat transformées par unité de temps par une enzyme à saturation de son site unique de fixation (turn over number). Elle est équivalente à une constante catalytique. Sa valeur est de 1 à 10 000 par seconde.

La majorité des réactions enzymatiques n'ont pas un seul mais plusieurs substrats. S'il s'agit d'une enzyme unique (et non d'un complexe multienzymatique), on mesure en général les paramètres de la réaction globale, du bilan réactionnel, en considérant qu'il n'existe qu'un seul V_max et un seul K_M apparents. L'analyse plus fine des diverses étapes et interactions est plutôt du ressort de l'analyse des états intermédiaires, des états de transition et des mécanismes réactionnels.

L'équation de Michaelis-Menten décrit bien la majorité des actions enzymatiques. Une exception remarquable est constituée par la famille des enzymes dites allostériques. Dans ce cas, la représentation de l'évolution de la vitesse initiale de réaction en fonction de la concentration du substrat ne suit pas une courbe hyperbolique mais décrit une sigmoïde. L'interprétation de ce phénomène, à l'origine perçu sur de seules bases cinétiques, est qu'il existe une coopérativité entre sous-unités de l'enzyme (les enzymes allostériques sont toutes multimériques), l'occupation d'un premier site sur un monomère facilitant la fixation sur le suivant (sur le second monomère et ainsi de suite). Il s'agit d'un mécanisme clé dans l'ajustement immédiat de l'activité des enzymes aux besoins de[...]