GÉNIE GÉNÉTIQUE
Isolement et amplification des gènes
Clonage d'un fragment de gène
Encyclopædia Universalis France
Pour comprendre le fonctionnement des organismes et éventuellement les modifier, il est nécessaire de connaître la structure des gènes. Un gène humain représente, en moyenne, 0,0001 p. 100 du 1,8 mètre d'ADN que contient chacune de nos cellules. Sa longueur est donc en moyenne d'environ 0,0018 mm d'ADN. Aucune machine et aucun expérimentateur ne peut aisément manipuler individuellement des objets aussi petits. Des méthodes spécifiques ont donc dû être inventées pour isoler les gènes (fig. 3). Pour ce faire, l'ADN total (ADN génomique) de quelques milliards de cellules est tout d'abord isolé puis fragmenté soit par cassure mécanique, soit à l'aide d'enzymes, appelées enzymes de restriction, qui coupent l'ADN en des points précis.
Les bactéries contiennent, en plus de leur unique chromosome, des minichromosomes circulaires appelés plasmides. Ces structures, qui sont capables de s'autorépliquer, contiennent souvent des gènes de résistance à des antibiotiques. Les bactéries s'échangent aisément leurs plasmides et se transmettent ainsi leur résistance à des antibiotiques. Ces propriétés ont fait des plasmides un des outils essentiels pour l'isolement des gènes. Pour atteindre ce but, des millions de copies d'un plasmide, isolées à partir de bactéries en culture, sont dans un premier temps ouvertes en un endroit précis avec une enzyme de restriction. Les différents fragments d'ADN obtenus dans l'étape précédente sont mis en présence des plasmides ouverts. Chaque plasmide se lie au hasard à un fragment d'ADN et un seul. Une enzyme appelée ligase, ajoutée au mélange, soude les plasmides et les fragments d'ADN, reconstituant ainsi une multitude de plasmides fonctionnels contenant chacun un seul fragment d'ADN. Les plasmides sont ensuite transférés dans des bactéries dans des conditions où chaque bactérie ne garde qu'un seul plasmide. Les bactéries sont cultivées et sélectionnées en présence d'un antibiotique. Seules les bactéries qui contiennent un plasmide circulaire fonctionnel (contenant donc un gène de résistance à l'antibiotique) se multiplient de manière à ce qu'elles forment des colonies isolées les unes des autres. Chaque colonie contient donc un type de bactérie qui présentent toutes le même plasmide et, donc, le même fragment d'ADN génomique. Les colonies sont amplifiées et les plasmides sont isolés à partir de chaque colonie de bactéries. Les fragments d'ADN peuvent alors être ressortis des plasmides en les coupant avec des enzymes de restriction. Le passage par les bactéries permet donc deux choses :
– un isolement des différents fragments d'ADN qui sont chacun dans une des colonies de bactéries. Cette opération repose sur le clonage de bactéries. Par extension et abus de langage, elle constitue ce que l'on appelle le clonage de gènes. Ce clonage n'a qu'un rapport formel avec le clonage des animaux. Dans ce dernier cas, en effet, des animaux génétiquement identiques sont expérimentalement multipliés, comme cela est le cas, dans une certaine mesure, avec les colonies de bactéries ;
– une multiplication de chaque fragment d'ADN, qui permet d'en disposer en quantité suffisante. Les opérations de génie génétique qui mettent en œuvre des fragments d'ADN purifié sont alors possibles.
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Écrit par
- Louis-Marie HOUDEBINE : directeur de recherche, unité de biologie du développement et reproduction, Institut national de la recherche agronomique
Classification
Médias
Gènes et protéines
Encyclopædia Universalis France
Clonage d'un fragment de gène
Encyclopædia Universalis France
Représentation schématique du code génétique
Encyclopædia Universalis France
Autres références
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TECHNIQUES DU GÉNIE GÉNÉTIQUE - (repères chronologiques)
- Écrit par Nicolas CHEVASSUS-au-LOUIS
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1962 Découverte, par Werner Arber, des enzymes de restriction, enzymes bactériennes capables de couper l'ADN.
1971 Première utilisation, par Daniel Nathans, des enzymes de restriction comme ciseaux moléculaires : découpage de l'ADN du virus SV40.
1975 Mise au point, par Edwin Southern,...
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