HISTOLOGIE

L'innovation méthodologique

Mais des outils supplémentaires actuellement utilisés en histologie moléculaire permettent d'observer les molécules in situ.

– L'histochimie et l'histoenzymologie regroupent de nombreuses techniques permettant de mettre en évidence différents constituants chimiques des tissus (lipides, glucides, protéines, acides nucléiques, métaux, enzymes, etc.). Depuis les années 1970, l'histochimie a également pu devenir quantitative grâce à la microspectrophotométrie puis à l'analyse d'images.– La lectinocytochimie utilise des lectines, protéines d'origine animale, végétale ou bactérienne, caractérisées par leur capacité de reconnaître des copules hydro-carbonées et de s'y lier. Comme les lectines sont spécifiques d'un sucre particulier, la lectinocytochimie est un bon outil pour étudier la composition chimique des membranes. Les lectines peuvent être détectées en microscopie optique ou électronique grâce à leur marquage (fluorochrome, enzymes, biotine, or colloïdal, etc.).

– Les techniques immunohistochimiques permettent la détection et la localisation précise des molécules protéiques. Elles ont pour but commun la visualisation sur coupes histologiques de sites antigéniques ayant réagi avec des anticorps mis au contact de la coupe. Les techniques d'immunofluorescence consistent à coupler à l'anticorps choisi un produit fluorescent qui permettra de localiser le site de la réaction antigène-anticorps en observant ces coupes en microscopie optique à rayons ultraviolets. Dans les techniques immuno-enzymatiques, les anticorps sont conjugués à une enzyme (peroxydase du raifort ou phosphatase alcaline, le plus souvent) qui peut être visualisée dans les tissus par l'utilisation d'un chromogène comme la diaminobenzidine, qui donne lieu à un produit de réaction brun directement observable en microscopie optique, ou comme le BCIP (bromo-chloro-indolyl-phosphate) qui génère du formazan de couleur pourpre en présence de nitrobleu de tétrazolium (NBT). Les méthodes immuno-enzymatiques présentent le grand avantage, par rapport à celles d'immuno-fluorescence, de pouvoir être utilisées sur du matériel fixé dans le formol et inclus en paraffine et aussi de pouvoir être adaptées à l'observation en microscopie électronique, en utilisant par exemple un marquage des anticorps par des particules d'or colloïdal de différents diamètres. L'utilisation en immunohistochimie du système biotine-avidine est applicable à beaucoup de problèmes. La biotine (petite vitamine hydrosoluble) peut être attachée à de nombreuses substances et ensuite détectée par sa liaison de haute affinité et de grande spécificité à l'avidine, elle-même couplée à un fluorochrome, à une enzyme ou à de l'or colloïdal. On peut également localiser la biotine ou la digoxigénine en utilisant des anticorps antibiotine ou antidigoxigénine marqués.

– L'hybridation in situ permet la détection et la localisation précise de séquences d'ADN ou d'ARN. Elle repose sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou ARN-messager ou oligonucléotide) avec une séquence complémentaire d'acides nucléiques que l'on cherche à identifier et à localiser sur une coupe histologique de tissu. Le marquage des sondes peut être réalisé par des isotopes radioactifs ou par des produits non radioactifs, soit fluorescents soit non fluorescents comme la biotine, la digoxigénine ou des enzymes. Le mode de révélation varie en fonction de la nature du marquage, autoradiographies, microscopie[...]