MICROSCOPIE

Microscope conventionnel à transmission

La colonne d'un microscope électronique est formée d'un empilement, généralement vertical, d'éléments : le canon à électrons, les lentilles au milieu desquelles est placé l'échantillon, la chambre d'observation. Ces trois parties servent respectivement à produire et à accélérer les électrons, à les dévier et à les focaliser le long de trajectoires les amenant à traverser l'échantillon dans des conditions déterminées, et à les détecter. Dans tout l'espace où se meuvent les électrons règne le vide ou, plus exactement, une pression très faible, au moins inférieure à 10⁻⁵ torr (1 torr = 1 mm de mercure). La tendance actuelle est d'améliorer la qualité de ce vide aux alentours de 10⁻⁹ torr afin de préserver la propreté de la surface libre de l'échantillon.

La source d'électrons assume une double fonction, à savoir produire les électrons et les accélérer. L'émission des particules peut être obtenue de deux façons différentes.

Dans un canon de type classique, un filament en forme de V en tungstène ou un petit cristal pointu d'hexaborure de lanthane est chauffé par un courant électrique à une température de l'ordre de 1 900 à 3 000 ⁰C. Le filament est entouré d'un cylindre, appelé wehnelt ; en dessous se trouve l'anode, percée comme le wehnelt d'une ouverture pour laisser passer le faisceau électronique. La distance entre le wehnelt et l'anode est de l'ordre du centimètre. L'anode est à la masse, le filament est à la haute tension négative, par exemple 100 kV ; le potentiel du wehnelt diffère de celui du filament de quelques centaines de volts. Il sert, comme la grille d'une triode, à régler l'intensité du faisceau électronique. Pour les microscopes à plus haute tension, jusqu'à 1 000 kV et même au-dessus, une succession d'électrodes portées à des tensions croissantes joue le rôle d'un petit accélérateur de particules.

Un second type de canon utilisé est le canon à émission de champ. Il ne nécessite aucun chauffage de l'émetteur d'électrons. Le filament est ici constitué d'un fil de tungstène en forme de pointe, dont le rayon de l'extrémité est de l'ordre de 10⁻⁷ m. Il est porté à un potentiel négatif de quelques kilovolts par rapport à une première anode extractrice : il en résulte un champ électrique très intense au voisinage de la pointe. Sous l'action de ce champ, les électrons sont arrachés de l'extrémité par effet tunnel. Ce canon présente une brillance plus grande que le canon classique permettant en particulier de concentrer un faisceau de l'ordre du nanoampère dans une sonde de l'ordre du nanomètre. En contrepartie, il est nécessaire d'assurer un très bon vide (10⁻¹¹ torr) autour du filament.

Dans les deux cas, le faisceau accéléré comporte ou semble provenir d'une partie rétrécie, ou « cross-over », qui joue le rôle de source virtuelle d'électrons vis-à-vis de la colonne du microscope. Dans la succession de lentilles magnétiques qui constituent cette dernière, les électrons sont soumis à des forces de Lorentz tout au long de leurs trajectoires dans les champs magnétiques associés. Dans une description simplifiée, on peut représenter ces trajectoires au moyen de rayons comme dans le cas des lentilles minces de l'optique photonique.

Pratiquement, les lentilles magnétiques sont des électroaimants de révolution percés d'un canal axial à travers lequel passent les électrons. Elles sont donc formées d'un bobinage, d'une carcasse de fer doux et de pièces polaires. Le bobinage est constitué par un grand nombre de tours de fils de cuivre ; il est parcouru par un courant destiné à créer un champ magnétique. Ce champ est concentré dans l'entrefer grâce à la carcasse et aux pièces polaires. Il agit sur les électrons en leur imprimant un mouvement spiral et focalisant le long de leur direction de propagation. Contrairement à l'optique photonique, il ne peut pas exister en optique électronique de lentilles divergentes. Mais leur propriété focalisante (ou leur distance focale) peut être modifiée continûment en faisant varier le courant parcourant le bobinage.

Les lentilles traversées successivement par les électrons sont : le condenseur, l'objectif, la lentille intermédiaire et le projecteur.

Le condenseur permet d'éclairer une partie plus ou moins grande de l'objet, c'est-à-dire soit en mode parallèle, soit en mode focalisé. Les microscopes possèdent maintenant trois ou quatre condenseurs afin d'offrir une large gamme de modes d'éclairement.

L'objectif est la lentille principale, car de ses propriétés dépendent les performances du microscope en termes de pouvoir de résolution. Il donne de l'objet un diagramme de diffraction dans son plan focal et une première image agrandie. Il a une courte distance focale f, par exemple de 1 à 3 mm ; il agrandit quelques dizaines de fois. À l'intérieur de l'objectif, un porte-objet permet de déplacer l'objet étudié pour choisir la partie examinée. Ce porte-objet doit aussi souvent incliner l'objet par rapport au faisceau, pour pouvoir changer l'angle de visualisation et en effectuer ainsi une étude tridimensionnelle.

Les deux ou trois lentilles situées au-dessous de l'objectif (lentilles intermédiaires ou projecteurs) agrandissent le cliché de diffraction ou l'image, selon qu'elles conjuguent avec le plan d'observation le plan focal ou le plan image de l'objectif.

Traditionnellement, l'image ou le cliché de diffraction est visualisé sur l'écran fluorescent afin de réaliser la meilleure mise au point et enregistré photographiquement sur un film escamotable. De nos jours, la tendance est de compléter ces techniques classiques d'enregistrement au moyen de caméras de télévision de bas niveau de lumière pour améliorer les conditions fines de réglage du microscope à très haute résolution et fort grandissement. En outre, les nouvelles générations de caméras à réseaux de détecteurs semiconducteurs (C.C.D.) permettent un enregistrement numérique des données sur une large gamme d'intensités et constituent la voie privilégiée pour toutes les possibilités de traitement digital a posteriori.

Les échantillons destinés à être observés par transparence doivent être suffisamment minces pour que les électrons transmis y subissent un nombre réduit d'interactions, conservant ainsi un degré satisfaisant de collimation et de dispersion énergétique pour donner lieu à des images finales de bonne qualité. Il n'existe pas de critère simple de définition d'une épaisseur critique, celle-ci dépendant de l'information et de la résolution recherchées. On peut cependant admettre que cette épaisseur est de l'ordre de quelques dizaines à quelques centaines de nanomètres pour des électrons d'énergie primaire de 100 ou de 200 keV. Pour des électrons de plus haute énergie, la pénétration est accrue et on peut obtenir des images nettes avec des échantillons d'épaisseur typique de un micromètre. Cela a constitué un des grands succès des microscopes de 1 MeV et de 3 MeV construits à Toulouse sous l'impulsion de Gaston Dupouy dans les années 1960.

Pour obtenir ces échantillons minces, un grand nombre de techniques ont été élaborées, dépendant de la nature du matériau. Certaines, très élémentaires, consistent à le broyer en de très fines particules et à en recueillir des éclats sur des substrats spéciaux de carbone à trous. Pour les matériaux les plus résistants, toutes les possibilités d'amincissement chimique, électrolytique ou sous abrasion ionique sont aujourd'hui utilisées. On peut aussi faire croître des couches minces à partir de rien par dépôt en phase vapeur sur des substrats variés que l'on dissout ensuite dans des bains appropriés. Pour la matière plus molle des polymères ou du monde biologique, il existe un vaste arsenal de techniques de fixation chimique ou physique, d'enrobage, de découpe avec un appareil de microtomie. Il ne faut pas sous-estimer l'importance de cette étape de préparation de l'échantillon, même si elle prend parfois des allures de recette de cuisine, car c'est souvent de la qualité de l'échantillon observé que dépend le résultat de l'observation et de la mesure.

Microscope à balayage

Dans ce type de microscope, l'image est obtenue séquentiellement point par point en déplaçant la sonde d' électrons primaires sur la surface de l'échantillon. L'image est alors reconstruite en utilisant le signal généré par différents détecteurs pour moduler la brillance d'un tube cathodique. Un tel instrument possède donc un certain nombre de composants semblables à ceux du microscope décrit ci-dessus. Il s'agit du canon à électrons et de l'ensemble des lentilles destinées à focaliser le faisceau primaire en un spot ponctuel. Les meilleures performances sont obtenues lorsqu'on peut focaliser un courant intense dans une tache aussi petite que possible : les paramètres importants sont alors la brillance du faisceau primaire, que l'on accroît par utilisation d'une source à effet de champ, et les propriétés optiques de la dernière lentille focalisante.

Deux grandes familles de microscopes à balayage se distinguent par la nature de l'échantillon observé : les microscopes à réflexion, qui concernent les échantillons massifs et les microscopes à transmission, qui concernent les échantillons minces. Dans le premier cas, on recueille les signaux résultant de la cascade complexe de chocs à l'intérieur du spécimen entre les échantillons incidents et les atomes de la cible, et dont seule une faible fraction est réémise par la surface extérieure : électrons rétrodiffusés et électrons secondaires pour déterminer la topographie superficielle, rayons X pour l'analyse chimique d'un volume typiquement de l'ordre du micromètre cube. Les détecteurs placés en regard de l'échantillon doivent être adaptés à la spécificité de ces différents signaux, et une attention spéciale est portée à l'électronique de mise en forme.

Pour le microscope de type S.T.E.M., l'approche générale est similaire, mais les détecteurs privilégiés sont alors le détecteur annulaire, qui recueille les électrons diffusés à grand angle au cours de la traversée de l'échantillon, et le spectromètre de pertes d'énergie, qui mesure la distribution en vitesse des électrons transmis. Le volume générateur de ces signaux utiles peut alors être réduit à la taille minimale de la sonde et à une épaisseur très faible, ce qui fait de ce type d'instrument l'appareil le plus performant pour l'analyse ultime.

Pouvoir de résolution du microscope électronique

Pour illustrer cette richesse du champ d'applications, nous allons montrer d'abord comment le pouvoir de résolution du microscope électronique moderne est adapté à l'imagerie des structures atomiques.

Les qualités d'un microscope électronique dépendent surtout de celles de son objectif, car ce sont les défauts de l'image qu'il donne qui sont amplifiés par la lentille intermédiaire et le projecteur. Les défauts les plus importants ou, pour employer le vocabulaire usuel, les aberrations sont : l'aberration de diffraction,l'aberration de sphéricité, l'aberration chromatique et l'astigmatisme (cf. optique Optique instrumentale).

Le phénomène de diffraction par une ouverture de taille finie intervient sur les ondes corpusculaires de façon identique à son action sur les ondes de lumière. Il fournit d'un point source objet une image, la tache d'Airy, dont le diamètre varie en λ/α, c'est-à-dire inversement proportionnellement à l'ouverture angulaire α de la lentille.

L' aberration de sphéricité (C_S, exprimée en millimètre comme la distance focale f) provient du fait que la lentille focalise davantage les rayons qui y pénètrent sous une inclinaison élevée. Elle fournit d'un point objet une image floue dont le diamètre varie comme la puissance cubique de l'ouverture α. Par conséquent, elle oblige à diaphragmer énormément le faisceau qui y pénètre. Les lentilles électroniques sont beaucoup moins ouvertes que les lentilles de l'optique photonique. La raison en est qu'il n'existe pas en optique électronique de lentilles divergentes dont les défauts corrigeraient ceux, opposés, des lentilles convergentes.

Le rôle opposé de ces deux termes de diffraction et d'aberration de sphéricité en fonction de l'ouverture de la lentille objectif conduit donc à rechercher une ouverture optimale, conduisant à un compromis entre ces deux termes. Il lui correspond donc une résolution optimale qui est de l'ordre de 0,5 C_S^1/4 . λ^3/4 et qui correspond à une ouverture de l'ordre de quelques milliradians. Contrairement au cas où la résolution est limitée par la seule influence de la diffraction, son comportement est plus complexe. Pour améliorer la résolution, on a donc intérêt à diminuer la longueur d'onde des électrons et à réduire le coefficient d'aberration sphérique de l'objectif par un meilleur confinement du champ magnétique intense qui règne entre les pièces polaires. Ce qui conduit aux meilleures résolutions existant actuellement sur le marché, à savoir 0,19 nm à 200 kV avec C_S = 0,4 mm, et 0,11 nm à 1 200 kV avec C_S = 1,5 mm, c'est-à-dire des valeurs tout à fait suffisantes pour résoudre les distances interatomiques dans un cristal, tout en étant environ cent fois supérieures à la longueur d'onde.

L' aberration chromatique des lentilles est associée à la dispersion de largeur non nulle de leur distance focale pour une distribution non monochromatique des électrons. Pour la réduire, il est nécessaire de stabiliser, avec une précision de l'ordre de quelques millionièmes, aussi bien la tension accélératrice que le courant dans les lentilles, puisque la distance focale dépend de ces deux quantités.

Enfin, le terme d'astigmatisme n'est pas considéré comme un paramètre limitatif dans le pouvoir de résolution car les objectifs sont toujours munis de stigmateurs grâce auxquels on peut rétablir la symétrie de révolution du champ de l'objectif.

« Voir » l'ultrastructure des tissus et des cellules

L' observation des tissus ou des cellules en culture a bénéficié des progrès des méthodes de fixation et d'inclusion qui permettent la réalisation en routine de coupes fines (0,1 μm) dans différents types de résines, éventuellement hydrosolubles, qui sont choisies en fonction de ce qu'on cherche à voir dans les objets inclus. Des cellules ayant subi divers traitements, ou sur lesquelles bourgeonnent des virus sont aisément étudiées par l'observation de telles coupes. La fixation par le froid (congélation rapide des tissus par l'hélium ou azote liquide suivie d'une fixation chimique) permet une excellente préservation des organites cellulaires. De nouvelles méthodes se développent actuellement, qui utilisent la congélation sous haute pression, ou la fixation chimique rapide assistée d'un traitement par des micro-ondes, similaires à celles qui sont utilisées pour la cuisson des aliments. Les biologistes utilisent ce type de préparation pour la détection d' antigène (immuno-cytochimie), ou de certaines séquences dans les acides nucléiques, avec des sondes complémentaires de ces séquences ( hybridation in situ). Le développement de la biologie moléculaire permet de fabriquer une variété infinie d' anticorps monoclonaux et de fragments d'ADN synthétiques, qui permettent une localisation très fine des constituants cellulaires. Ces anticorps et sondes moléculaires sont rendus visibles sur les coupes soit à l'aide de marqueurs le plus souvent constitués de billes d'or colloïdal (de 1 à 40 nm) fixées sur les molécules d'anticorps (IgG) ou sur les sondes d'ADN marquées à la biotine, soit par la méthode d' autoradiographie qui permet de localiser les sites où une sonde d'ADN radioactive s'est fixée dans les cellules. La cryo-ultramicrotomie permet de réaliser des coupes de tissus congelés dans lesquels les constituants cellulaires sont particulièrement bien accessibles, du fait de l'absence de résine d'inclusion.

Ces techniques de froid apportent une autre dimension aux observations : il est possible de fracturer sous vide un tissu congelé et de lyophiliser une partie de l'eau contenue dans les couches superficielles. Cette surface décapée plus ou moins profondément est rendue visible par métallisation, fournissant une vision très claire des organites cellulaires, les répliques ainsi faites pouvant être observées en microscopie par transmission ou en microscopie à balayage à haute résolution.

Les méthodes analytiques utilisant la spectrométrie X et la perte d'énergie des électrons sont également utilisées en biologie, et permettent la localisation et la quantification d'accumulations locales dans des cellules d'atomes d'origine physiologique comme le calcium, ou d'origine externe, tels que des dépôts de métaux toxiques dans le poumon.

« Voir » les molécules

Des progrès considérables ont été apportés par la microscopie électronique dans la visualisation des macromolécules isolées. Parmi celles-ci, les acides nucléiques, les protéines et certains polysaccharides ont fait l'objet de très nombreuses études. Il est important de bien comprendre que la microscopie électronique ne remplacera jamais les méthodes biophysiques d'analyse structurale des molécules que sont la cristallographie par les rayons X et la résonance magnétique nucléaire (R.M.N.), méthodes qui fournissent des cartes structurales des molécules avec des résolutions de quelques dixièmes de nanomètres. Ces méthodes nécessitent l'obtention de cristaux diffractant les rayons X pour la première, et des molécules de poids moléculaire inférieur à 20 000 daltons pour la R.M.N. Dans les deux cas, des protéines très pures et très concentrées (plusieurs mg/ml) sont nécessaires. La microscopie électronique bénéficie de la possibilité unique de voir les molécules individuellement, donc de pouvoir utiliser les méthodes statistiques d'étude des populations.

Les techniques utilisées pour fixer les molécules sur un support et les contraster dépendent des molécules à observer. Les protéines assez grosses pour être directement visibles (d'une taille supérieure à 5 nm, ou ayant une forme caractéristique) peuvent être enrobées d'un film de sels de métal lourd, uranium ou tungstène, qui fournira le contraste. Cette méthode, dite de coloration négative, est plus résolutive que la décoration par métallisation (aussi appelée ombrage) qui, pour être valable, doit être réalisée sur des protéines lyophilisées. Les molécules comme l'ADN peuvent être « colorées » par des métaux lourds et observées en fond noir. L'ombrage fournit également d'excellents résultats pour visualiser les molécules filamenteuses (acides nucléiques et polysaccharides).

Observation des protéines

La structure de nombreuses protéines a pu être déterminée à partir d'images de coloration négative. Les molécules sont vues individuellement, et des traitements statistiques permettent de les aligner, de réaliser des « moyennages » d'images à partir desquelles des reconstructions tridimentionnelles peuvent être faites si l'on dispose d'images inclinées. Ces méthodes de tomographie ont permis d'obtenir des images en trois dimensions de nombreuses protéines et d'autres particules biologiques comme des virus. Ces résultats peuvent remplacer – ou être complémentaires de – ceux qui sont obtenus avec la cristallographie ou la R.M.N., méthodes qui ne sont pas utilisables avec toutes les macromolécules biologiques. Une autre approche, complémentaire de la coloration négative, consiste à observer des molécules flottant dans un film de glace amorphe, obtenu par congélation ultrarapide d'un film d'eau très mince (de 50 à 100 nm environ) contenant les molécules. L'absence de support permet d'obtenir des molécules orientées de façon libre, et l'absence de produit contrastant d'éviter des artefacts.

Une étape complémentaire consiste à réaliser des cristaux en deux dimensions, qui peuvent être observés en coloration négative, ou même dans la glace comme pour les molécules isolées. Un traitement informatique des images peut être fait sur les zones qui présentent un bon arrangement des protéines, ce qui permet de réaliser des reconstructions tridimentionnelles de la protéine. La diffraction des électrons, qui peut être obtenue avec certains cristaux de protéines, a conduit à des analyses cristallographiques qui rejoignent en résolution les résultats de la cristallographie avec les rayons X.

Observation des acides nucléiques

Les molécules d' acides nucléiques, et tout particulièrement l' ADN double chaîne, sont visibles en microscopie électronique à condition de les étaler et de les déposer sur les supports compatibles avec l'observation au microscope. Traditionnellement, l'étalement s'obtient en mélangeant l'ADN avec le cytochrome c, protéine qui se complexe à l'ADN et forme un film très fin à la surface de l'eau. Ce film récupéré sur un support en carbone mince (de 3 à 10 nm) est ensuite contrasté par ombrage. Une méthode plus résolutive consiste à adsorber les molécules à partir de leur solution, sur un film de carbone déposé sur un treillis, et à les contraster par une imprégnation par un sel d'uranium. Un bon contraste est obtenu par l'observation de ces préparations en fond noir. Le contour des molécules peut être suivi aisément, et des informations topologiques (forme supertorsadée des molécules circulaires, par exemple) peuvent être obtenues. Un suivi de contour des filaments permet de mesurer des paramètres comme la courbure locale, qui peut être corrélée à la séquence de l'ADN étudié. Ces paramètres sont très utiles à connaître pour étudier les interactions entre les molécules d'ADN et des protéines qui interviennent dans sa compaction, telles que les histones qui forment les nucléosomes, ou des protéines responsables de la régulation de l'expression des gènes. Une technique plus délicate dans sa pratique consiste à observer les molécules d'ADN flottant dans un mince film de glace. Cela permet, à l'aide de vues stéréoscopiques, de déterminer la conformation réelle des molécules telle qu'elle était dans la solution aqueuse d'origine.

Toutes ces méthodes d'observation des molécules d'ADN – seules ou en association avec des protéines ou des ligands variés, telles que des drogues antitumorales – sont complémentaires des méthodes traditionnelles de la biochimie. Leur utilisation conjointe est de plus en plus utilisée de nos jours.

Les techniques d'observation de l'ADN double chaîne sont valables pour l'étude de l'ADN simple chaîne et de l'ARN, qui présente souvent des segments simple et double chaîne. Elles sont plus délicates d'emploi, mais permettent d'aborder des problèmes difficiles comme l'étude de la structure du génome de virus à ARN comme le VIH.