PCR (polymerase chain reaction) ou AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE
Les étapes d'une PCR classique
Quelle que soit l'opération menée, l'extraction de l'ADN précède son amplification. L'ADN est extrait à partir de l'échantillon qu'on souhaite analyser (salive, sang, cheveux, prélèvement issu d'une biopsie, poudre d'os actuel ou ancien, etc.). L'opération peut être menée à partir d'une seule cellule, un spermatozoïde par exemple, voire de fragments dégradés de l'ADN. Des microméthodes d'extraction ont donc été mises au point.
C'est à ce stade que se situe la principale difficulté de la PCR : une contamination par un ADN étranger fausserait les résultats s’il était amplifié en même temps ou à la place de l'ADN qu'on souhaite étudier. Pour éviter de telles contaminations, des pièces séparées dans le laboratoire sont réservées à chaque étape : extraction d'ADN ; préparation du mélange réactionnel ; amplification elle-même ; étude des produits amplifiés enfin. De plus, on utilise un matériel stérile (récipients, pipettes, etc.) à chaque étape ; les réactifs sont également stérilisés et préparés en petites fractions correspondant au volume suffisant pour une seule expérience ; l'opérateur porte un masque et des gants. L’étape suivante, la conception des amorces d'amplification, est également critique. Il faut en effet construire les amorces pour la réaction d'amplification en les adaptant à chaque situation. Pour ce faire, il est nécessaire de connaître les séquences de nucléotides qui encadrent la séquence d'ADN qu'on souhaite amplifier et de choisir celles qui ne provoqueront pas de réactions parasites. Les amorces s'accordant aux séquences complémentaires de ces fragments sont produites dans un synthétiseur d'ADN.
Tous les éléments nécessaires à la réaction sont ensuite mélangés dans un même tube contenant un milieu réactionnel adapté aux caractéristiques optimales pour le bon fonctionnement de l'enzyme. Ce sont : l'ADN total extrait qui contient l'ADN à amplifier, servant de matrice lors des premiers cycles d'amplification ; une polymérase thermostable ; les deux amorces en très forte concentration initiale ; les nucléotides (A, T, G, C) qui seront intégrés par la polymérase dans le brin d'ADN qu'elle synthétise.
La réaction d'amplification consiste en une succession de vingt à quarante cycles, qui comportent chacun trois étapes d'une durée de quelques secondes à quelques minutes à des températures différentes :
– La dénaturation thermiquede l'ADN. Les fragments d'ADN sont chauffés à haute température (aux alentours de 95 0C). L'ADN double brin est dénaturé en ADN simple brin qui devient accessible aux amorces.
– L 'hybridation des amorces. Le mélange réactionnel est refroidi rapidement (températures de 45 à 60 0C), ce qui permet l'appariement des amorces à leurs régions complémentaires dans les brins d'ADN.
– L'extension, ou élongation (polymérisation). Elle correspond à l'élongation unidirectionnelle de chaque amorce hybridée par l'enzyme polymérase (le plus souvent aux alentours de 72 0C). L'enzyme copie le brin d'ADN matrice en ajoutant des nucléotides à l'une des extrémités de chaque amorce : un A en face d'un T, un G en face d'un C ; bref, elle copie exactement, en respectant les règles d'appariement. Le résultat est un ADN double brin.
Après l'extension, le cycle recommence, à la différence près que les fragments précédemment synthétisés servent de matrice pour la synthèse de nouveaux fragments d'ADN : après quelques cycles, l'ADN néosynthétisé se comporte comme la matrice dominante. Le taux d'amplification théorique est de 2n, n étant le nombre de cycles. Pour trente cycles, à partir[...]
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Écrit par
- Véronique BARRIEL : maître de conférences au Muséum national d'histoire naturelle, Paris
Classification
Médias
Généalogie du dodo
Illustration by Christian Friedrich Stölzel
Appariement des brins d’ADN
Encyclopædia Universalis France
Cinétique d’une réaction de PCR
Encyclopædia Universalis France
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POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
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