PLASMIDES

La réplication

On appelle réplication l'ensemble des processus qui aboutissent à la synthèse de nouvelles molécules d'ADN plasmidique ; identiques au plasmide originel, ces copies plasmidiques seront réparties dans les cellules filles au cours de la division bactérienne. Pour qu'un plasmide soit viable, son génome doit contenir nécessairement l'information pour des fonctions minimales ou fonctions d'autonomie qui définissent son individualité : c'est-à-dire sa réplication autonome, le contrôle de cette réplication et de la répartition de ses copies de façon à maintenir un lien constant avec son hôte bactérien.

En 1963, François Jacob, Sydney Brenner et François Cuzin proposent un modèle selon lequel la réplication du plasmide commence en un point précis, l'origine, et progresse d'une manière séquentielle et linéaire vers un autre point spécifique, la terminaison, puis s'arrête ; une substance appelée « initiateur », codée par le plasmide lui-même, déclenche la réplication. La fixation du plasmide à la face interne de la membrane cellulaire est indispensable à la réplication et à la répartition des copies. À un certain stade du cycle de développement de la bactérie, un nouveau site de fixation se formerait, déclenchant la réplication, de telle sorte qu'une nouvelle molécule d'ADN vienne s'attacher au même site. Une cloison entre les deux sites de fixation assure la répartition d'une molécule plasmidique à chaque cellule fille. D'après ce modèle, une très petite partie du génome du plasmide est nécessaire pour assurer les fonctions d'autonomie. L'étude de délétions affectant différents plasmides ainsi que des expériences plus récentes de clonage moléculaire ont permis de confirmer cette hypothèse. Les gènes responsables de l'autonomie, donc de la viabilité du plasmide, sont rassemblés sur ce que l'on appelle une « unité de conduite de réplication », petit segment d'ADN, dont la taille est d'environ 2 000 paires de bases, qui assure la réplication de structures plasmidiques contiguës cinquante fois plus longues. Actuellement, on définit quatre éléments dans l'unité typique de conduite de la réplication : l'origine (site d'initiation de la réplication), la substance initiatrice, les fonctions génétiques qui contrôlent le nombre de copies, et les fonctions qui assurent la répartition des copies dans les cellules filles. Des études utilisant des techniques de coupure de l'ADN plasmidique par des enzymes, les endonucléases de restriction qui coupent l'ADN en des sites spécifiques, ont permis d'isoler les origines de plusieurs plasmides. L'étude de mutants de plasmides instables à des températures élevées a montré qu'il existe un gène codant pour une protéine diffusible nécessaire à la réplication et que cette protéine initiatrice est spécifique de chaque plasmide. La réplication plasmidique n'est pas comme on l'avait d'abord envisagé couplée à la réplication chromosomique et sous son contrôle. La réplication plasmidique est contrôlée indépendamment de la réplication du chromosome.

Le nombre de copies de plasmide par chromosome ou par cellule est très variable selon le plasmide, de une à deux copies à plus d'une centaine de copies ; plus le plasmide est grand, et plus le nombre de copies par cellule est faible. Plusieurs plasmides différents peuvent cohabiter dans la même bactérie avec un nombre de copies très différent, le nombre de copies étant déterminé par un système de régulation propre à chacun d'eux. Pour certains plasmides, il a été démontré que le nombre de copies est contrôlé par une ou plusieurs protéines inhibant la réplication ; il s'agit là d'un modèle de régulation négative par un répresseur. Pour qu'un plasmide présent dans une bactérie en un nombre limité de copies se transmette de façon stable au cours des générations, un mécanisme assurant l'égale répartition des copies dans les cellules filles doit exister. Des études sur des mutants plasmidiques à initiateur de réplication thermosensible ont apporté la preuve de l'existence de ce mécanisme de répartition. Les bactéries hébergeant de tels mutants plasmidiques peuvent encore se diviser à une température de 42 ⁰C, mais la réplication du plasmide ne se fait plus. À chaque génération, les copies se répartissent en nombre égal dans les cellules filles, aboutissant au fil des générations à des bactéries porteuses d'une seule copie plasmidique, puis à des bactéries dépourvues de plasmide et sensibles aux antibiotiques auxquelles elles étaient résistantes grâce à la présence du plasmide. À côté de ces fonctions nécessaires à leur existence même, les plasmides peuvent porter des gènes codant pour de très nombreuses propriétés dont certaines ont des conséquences d'une extrême importance pour l'épidémiologie de la résistance aux antibiotiques et pour la pathogénicité des bactéries.

Le transfert

Classiquement, on divise les plasmides en deux catégories : les plasmides conjugatifs et les plasmides non conjugatifs.

Un plasmide conjugatif code pour des fonctions nécessaires à son transfert d'une bactérie A à une bactérie B ; il est dit autotransmissible :

Les plasmides conjugatifs ont une masse moléculaire supérieure à 30 mégadaltons (Md), leur nombre de copies par chromosome est faible (de 1 à 3), leur présence détermine à la surface de la bactérie la synthèse de pili sexuels nécessaire à la conjugaison. Le transfert est le plus souvent réprimé et s'effectue à faible fréquence, de l'ordre de 10^—4 par bactérie donatrice. La conjugaison est réglée par une unité de transcription composée d'une vingtaine de gènes : l'opéron tra. Son déroulement fait intervenir plusieurs étapes successives : interactions pili-paroi aboutissant à la formation d'agrégats de bactéries, synthèse de l' ADN conjugatif ou « mobilisation », transfert dans la bactérie réceptrice d'un seul brin d'ADN plasmidique, synthèse du brin d'ADN complémentaire dans la bactérie receveuse et circulation de l'ADN plasmidique double brin.

Les plasmides non conjugatifs ont une masse moléculaire beaucoup plus petite que les plasmides conjugatifs, le plus souvent autour de 5 Md. Le nombre de copies de ces petits plasmides par copie de chromosome est élevé, supérieur à 10. Ces plasmides ne possèdent pas les gènes nécessaires à la conjugaison, cependant la plupart d'entre eux peuvent assurer l'étape de synthèse de l'ADN conjugatif. Si la bactérie hôte héberge par ailleurs un plasmide autotransférable, au cours de son transfert ce dernier est capable d'assurer le transfert simultané du plasmide non conjugatif par un mécanisme que l'on appelle « mobilisation ».

En définitive, le transfert et la dissémination des plasmides de bactérie à bactérie peut se faire soit par conjugaison, soit par mobilisation. La conjugaison est un phénomène très répandu chez les bacilles à Gram négatif ; plus récemment ce phénomène a été décrit chez les bactéries à Gram positif (streptocoques, staphylocoques, streptomyces, Clostridium...).

Conjugatifs ou non, les plasmides peuvent être disséminés par d'autres mécanismes : ainsi, au cours du transfert par transduction, l'ADN plasmidique est incorporé dans un bactériophage et il est injecté en même temps que l'ADN du phage dans la bactérie réceptrice. Enfin, l'ADN plasmidique peut être acquis par une nouvelle bactérie par un mécanisme de transformation (cf. parasexualité).

Les autres fonctions codées par les plasmides

En plus des gènes qui assurent leur réplication et leur dissémination, les plasmides sont le support d'un grand nombre de déterminants génétiques qui confèrent à l'hôte bactérien des activités biologiques très variées. Les plasmides codant pour la résistance aux antibiotiques ont été les plus étudiés à cause de leur importance clinique. Les plasmides peuvent coder pour la résistance à d'autres agents toxiques pour la bactérie : bactériocines, phages, métaux lourds, détergents, radiations, agents mutagènes, sérum. Les plasmides codant pour des caractères métaboliques confèrent à leurs hôtes la capacité d'utiliser comme aliments de nouvelles substances, leur permettant une meilleure adaptation à l'environnement. Enfin, certains caractères codés par des plasmides jouent un rôle essentiel dans la pathogénicité et la virulence de la bactérie hôte : facteurs d'adhérence, production de toxines, d'hémolysines, capacité d'induire des tumeurs chez les plantes. Un plasmide peut coder, et c'est fréquemment le cas, à la fois pour la résistance aux antibiotiques et une ou plusieurs autres propriétés.

Structure et isolement

Le plasmide est constitué d'une double hélice d'ADN circulaire surenroulé. Chaque brin est formé d'un enchaînement de quatre bases : adénine (A), guanine (G), thymine (T), cytosine (C), qui se succèdent selon une séquence caractéristique. La séquence des bases d'un brin est complémentaire de la séquence des bases de l'autre brin, A correspondant à T et C à G. La taille des plasmides est très variable, de 1/10 à 1/1 000 de la taille du chromosome bactérien.

L'isolement des plasmides peut être réalisé par plusieurs techniques : électrophorèse, ultracentrifugation, microscopie électronique. La microscopie électronique n'est pas un moyen d'isolement mais permet la visualisation et la mesure.

Critères d'identification et classification

Analyse d'hétéroduplex en microscopie électronique

On peut mesurer l'importance de l'homologie entre les ADN de deux plasmides par l'analyse d'hétéroduplex en microscopie électronique (fig. 5). Un hétéroduplex est le résultat de la réassociation de deux brins d'ADN provenant chacun d'un plasmide différent. Les régions constituées de doubles brins d'ADN correspondent aux régions d'homologie. Les boucles simple brin correspondent aux régions hétérologues. Cette technique permet de détecter et de mesurer l'homologie entre deux plasmides.