SONDES MOLÉCULAIRES
Molécules utilisées pour l'exploration des structures d'un être vivant ou pour l'identification des biomolécules qui en ont été extraites. Les sondes doivent être spécifiques. À cet égard, elles seront choisies soit parmi des acides nucléiques, mettant à profit le phénomène des complémentarités séquentielles qui sont le sceau de ces molécules, soit parmi des protéines identifiables comme anticorps ou antigènes dans les réactions immunologiques spécifiques.
Sondes radioactives. Plusieurs isotopes radioactifs sont utilisés comme marqueurs en hybridation moléculaire : 32P (activité spécifique de 400 à 3 000 Ci/mmol), 125I (de 1 500 à 2 000 Ci/mmol), 35S (de 400 à 1 000 Ci/mmol), 3H (de 30 à 85 Ci/mmol). Ils diffèrent par leur période, la nature des particules émises et leur énergie. La nature des particules et leur énergie interviennent dans la sensibilité et la résolution des clichés (autoradiogrammes) que la radioémission permet d'obtenir. Les sondes radioactives sont détectées après l'hybridation à l'aide d'un compteur, d'un scintillateur ou par autoradiographie.
L'autoradiographie est une méthode utilisée pour localiser, détecter, visualiser des traceurs radioactifs, à l'aide de surfaces photographiques sensibles apposées au contact de la membrane qui a servi de support à l'hybridation. Les radio−isotopes émettent des particules chargées qui induisent la formation d'images latentes dans certains des cristaux d'halogénures du film photographique.
Les sondes marquées par le 32P permettent de détecter une très faible quantité de cible complémentaire (0,01 pg). Cependant, plusieurs problèmes sont liés à l'utilisation des marqueurs radioactifs : la sécurité du manipulateur et de son environnement, l'élimination des déchets, un compromis entre la radioactivité spécifique du marqueur et sa stabilité et, enfin, la radiolyse (les particules émises lors des désintégrations peuvent rompre les liaisons chimiques et détruire la sonde nucléique).
Sondes non radioactives. Pour pallier ces inconvénients, on emploie maintenant plusieurs méthodes de marquage non radioactif par couplage covalent ou biospécifique d'un système de détection sur le fragment d'acide nucléique servant de sonde. Les marqueurs utilisés pour préparer des sondes non radioactives (« sondes froides ») sont soit des molécules de faible poids moléculaire (tétraméthylrhodamine, fluorescéine, nitrobenzofurane, éthydium, bimane, biotine, acétyl-aminofluorène, cytosine sulfonée, digoxigénine, 5-bromodésoxyuridine, etc.), soit des macromolécules (peroxydase, phosphatase alcaline, microperoxydase, papaïne, luciférase, etc.). Après hybridation, la sonde est détectée à l'aide de réactifs appropriés.
La détection du duplex qui s'est formé (ADN/ADN ou ADN/ARN) peut être réalisée grâce à la fluorescence émise par le fluorochrome ou grâce à l'activité catalytique de l'enzyme. Il est intéressant de noter qu'un marqueur enzymatique a une capacité d'amplification intrinsèque que n'ont pas les autres marqueurs, car une seule molécule d'enzyme est capable de transformer un grand nombre de molécules de substrat en molécules de produit, qui peuvent être ensuite détectées avec une bonne sensibilité par des méthodes colorimétriques, fluorimétriques ou luminométriques.
Le développement des techniques d'hybridation moléculaire non radioactive a permis aux laboratoires moyennement équipés ou non autorisés à manipuler des radio-isotopes d'accéder aux techniques modernes de biologie moléculaire jusque-là réservées aux laboratoires spécialisés.
Bibliographie
J.-L. Guesdon, « Principe de l'utilisation des sondes nucléiques », in L'Information scientifique du biologiste, no 2, Expansion[...]
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Écrit par
- Didier LAVERGNE : docteur en médecine
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